Epidemiological Typing and Mechanisms of Antibiotic Resistance in Clinically Relevant Klebsiella Pneumoniae Isolated at St. Marina University Hospital – Varna // Епидемиологично типизиране и механизми на антибиотична резистентност в клинично значими Klebsiella pneumoniae, изолирани в УМБАЛ „Света Марина“, Варна

Abstract

Целта на настоящия дисертационен труд е да се проучи чувствителността и механизмите на резистентността към бета-лактами и хинолони при клинично значими Klebsiella pneumoniае, изолирани от пациенти, хоспитализирани в УМБАЛ „Света Марина“ - гр. Варна в периода 2014 - 2017г. и да се определи клоналната свързаност на изолатите. Анализът на резултатите, получени в нашите проучвания и сравняването им с данните от литературата, ни дава основание да се направят следните изводи: 1. Изпитването на чувствителността към антимикробни лекарствени средства установи висок процент на резистентност към цефалоспорини от III генерация (54.8%) в проучваната колекция от 1084 изолата Klebsiella pneumoniae. Резистентните на цефалоспорини трета генерация изолати демострираха във висока степен резистентност към представители и на други антибиотични групи – piperacillin/tazobactam(96.5%),ciprofloxacin (96.5%), trimethoprime/sulphometoxazole (63.0%) и gentamicin (69.3%). В групата на карбапенем-резистентните K. pneumoniae, единствено ceftazidime/avibactam и amikacin демонстрираха най-добра in vitro активност. 2. Проведеният двойно-дисков синергистичен тест с цефалоспорини трета генерация и amoxicillin/clavulanic acid (20/10) за детекция на ESBL в изолати от K. pneumoniae, както и модифицираният Hodge тест, показаха сравнително добра чувствителност (81 % и 92% съответно). 3. Чрез метода на IEF в проучваните изолати се установи разнообразие от β-лактамази, включително и ко-продукция на няколко ензима. IEF в комбинация с биологичния тест за хидролитична активност потвърди в групата на проучваните изолати K. pneumoniae продукцията на два вида ESBLs (представени предимно от СТХ-М и при един изолат от SHV тип). В част от изолатите бяха доказани карбапенемази от KPC групата, VIM и OXA-48. AmpC ензими (DHA) бяха доказани както самостоятелно продуцирани така и в комбинация с CTX-M. При четири изолата се установи продукция на два вида CTX-M ензими. 4. Основният механизъм на резистентност към цефалоспорини от трета генерация в настоящата колекция от изолати K. pneumoniae се асоциира с продукцията на ESBLs в 96.9%, като най-чести са CTX-M бета-лактамазите в 93%, с водещото значение на CTX-M-15 (81.1%), следван от CTX-M-3 (9.4%). Резистентността към карбапенемни антибиотици се медиира от продукцията на карбапенемази, като KPC-2 е най-често продуцираната бета-лактамаза с карбапенемазна активност (21%). В единични изолати са доказни NDM-1 и VIM-1 метало-карбапенемази. 5. При положителните за blaCTX-M-15 изолати се доказа присъствие на IncF и нетипируеми плазмиди, а при положителни за blaCTX-M-3 – присъствие на IncL/M плазмиди. Проведените успешни конюгационни експерименти с blaCTX-M-15 и blaCTX-M-3 позитивни изолати потвърдиха плазмидната локализация на тези гени. В положителни за blaCTX-M-15 и bla КРС-2 изолати K. pneumoniae се установиха IncFII плазмиди. В единствения изолат ко-продуцент на blaCTX-M-15 и blaОХА-48 се доказа наличие на IncR плазмид. 6. Епидемиологичното типизиране чрез ERIC PCR и MLST доказа широко вътреболнично разпространение на няколко клона множествено резистентни K. pneumoniaе, продуциращи CTX-M-15 ESBL. ST15, съответстващ на ERIC тип A, е доминиращият секвенциален тип, персистиращ през целия проучван период (2014-2017г.), следван от ST11 (ERIC тип Р), появяващ се през 2015г. и присъстващ до края на проучвания период. Доминиращият ST15 тип демонстрира висок епидемичен и инвазивен потенциал и потенциал за крос-трансмисия и персистиране. Карбапенемаза-продуциращите изолати K. pneumoniae се асоциират с няколко различни STs: ST15, ST76, ST11, ST1350, ST151, ST35, ST395 и ST147. ST15 e носител на blaКРС-2 и blaOXA-48, ST76, ST1350, ST151, ST35 и ST395 – на blaKPC-2, а ST11 и ST147 – на blaNDM-1 и blaVIM-1 съответно. 7. В изследваните изолати K. pneumoniae се установи широко разпространение на oqxA (100%), oqxB (93%) и qnrB (40%) в асоциация с blaCTX-M-15. Доминиращият qnrB ген беше представен от qnrB9 (47.6%), следван от qnrB1 (36.5%), qnrB4 (16%) и слаба разпространеност на qnrS1, qnrA и Aac-(6’)-Ib-cr. В над 70% от изолатите бяха доказани хромозомни мутации за gyrA и/или parC гените, като в 66% се установиха едновременни мутации в двата гена. Субституциите в позиции Ser83Phe /Asp87Ala, Ser83Ile, Asp87Asn, Asp87Tyr за gyrА и позиции Ser80Ile за parC бяха доказани в изолатите с високо ниво на хинолонова резистентност. 8. В изследваните от нас изолати K. pneumoniae не бяха доказани mcr гени, асоцииращи се с плазмид-медиирана резистентност към colistin.

The study investigates the susceptibility and mechanisms of resistance to beta-lactams and quinolones in clinically significant Klebsiella pneumoniae isolated from patients hospitalized in the St. Marina University Hospital – Varna during the period 2014 – 2017, as well as to determine the clonal relation between the isolates. Analysing the results obtained in our studies and comparing them with literature data gives us grounds to draw the following conclusions: 1. Antimicrobial susceptibility testing demonstrated a high percentage of 3rd generation cephalosporin resistance (54.8%) in the collection of Klebsiella pneumoniae isolates. Third-generation cephalosporin-resistant isolates demonstrated high resistance to other antibiotic groups: piperacillin/tazobactam (96.5%), ciprofloxacin (96.5%), trimethoprime/sulphometoxazole (63.0%) and gentamicin (69.3%). Significantly higher levels of resistance were found in Klebsiella pneumoniae isolates from blood and urine compared to those from wound and respiratory tract secretions. Cephazidime/avibactam and amikacin demonstrated the best in vitro activity against carbapenem-resistant K. pneumoniae isolates. 2. А double-disc synergistic test with third-generation cephalosporins and amoxicillin/clavulanic acid for detection of ESBL in K. pneumoniae and the modified Hodge test, showed relatively good sensitivity (81% and 92%, respectively). 3. A variety of β-lactamases, including co-production of several enzymes, were identified in the studied isolates by IEF. The IEF in combination with the biological test for hydrolytic activity, confirmed the production of two types of ESBLs (mainly CTX-M type). Carbapenemases from the KPC group, VIM and OXA-48 were demonstrated in some of the isolates. AmpC enzymes (DHA) were detected in some of the isolates, incl. as co-production with CTX-M. Four isolates produced two types of CTX-M enzymes. 4. The main mechanism of 3rd generation cephalosporin resistance in the present collection of K. pneumoniae isolates is associated with the production of ESBLs in 96.9%, the most common being CTX-M beta-lactamases in 93%, with the leading CTX- M-15 enzyme (81.1%), followed by CTX-M-3 (9.4%). Carbapenem resistance was mediated by the production of carbapenemases, with KPC-2 being the most frequently produced beta-lactamase with carbapenemase activity (21%). NDM-1 and VIM-1 metallo-carbapenemases were demonstrated in single isolates. 5. The presence of IncF and untypable plasmids was demonstrated in the positive for blaCTX-M-15 isolates and the presence of IncL/M plasmids in the positive for blaCTX-M-3. Successful conjugation experiments with blaCTX-M-15 and blaCTX-M-3 positive isolates confirmed the plasmid localization of these genes. IncFII plasmids were identified in positive for blaCTX-M-15 and blaKRC-2 isolates of K. pneumoniae. In a single isolate - a co-producer of CTX-M-15 and OXA-48, a IncR plasmid was identified. 6. The epidemiological typing by ERIC PCR and MLST demonstrated widespread hospital prevalence of several clones of MDR K. pneumoniae, producing CTX-M-15 ESBL. ST15, corresponding to ERIC type A, is the dominant sequence type persisting throughout the study period (2014-2017), followed by ST11 (ERIC type P) appearing in 2015 and present until the end of the study period. The dominant ST15 type demonstrates high epidemic and invasive potential and potential for cross-transmission and persistence. Carbapenemase-producing isolates of K. pneumoniae are associated with several different STs: ST15, ST76, ST11, ST1350, ST151, ST35, ST395, and ST147. ST15 carries blaKPC-2 and blaOXA-48, ST76, ST1350, ST151, ST35 and ST395 - blaKPC-2, and ST11 and ST147 - blaNDM-1 and blaVIM-1 respectively. 7. OqxA (100%), oqxB (93%) and qnrB (40%) in association with blaCTX-M-15 were found to be widespread in the tested K. pneumoniae isolates. The dominant qnrB gene was represented by qnrB9 (47.6%), followed by qnrB1 (36.5%), qnrB4 (16%). A low prevalence of qnrS1, qnrA and Aac- (6 ') - Ib-cr was found. Chromosomal mutations in gyrA and/or parC genes were demonstrated in over 70% of isolates, with simultaneous mutations in both genes in 72%. Substitutions in Ser83Phe/ sp87Ala, Ser83Ile, Asp87Asn, Asp87Tyr for gyrA, and Ser80Ile – for parC, were found in isolates with high level quinolone resistance. 8. The mcr genes associated with plasmid-mediated colistin resistance were not demonstrated in the tested K. pneumoniae isolates.