Microbiological and Molecular Genetic Research on Epidemiology and Resistance to Antimicrobial Drugs in Clinical Isolates. Stenotrophomonas maltophilia //// Микробиологични и молекулярно-генетични проучвания върху епидемиологията и резистентността към антимикробни лекарствени средства в клинични изолати. Stenotrophomonas maltophilia

Abstract

Цел на дисертационния труд е извършване на микробиологични и молекулярно-генетични проучвания върху епидемиологията и резистентността към антимикробни лекарствени средства сред клинични изолати Stenotrophomonas maltophilia. Проучването обхваща общо 168 изолата Stenotrophomonas maltophilia, изолирани за период от осем години от 2007 до 2015г. в 4 болнични заведения в България. Идентификацията е извършена чрез конвенционални биохимични методи, мануална идентификационна система Crystal и автоматизирана – Phoenix. Чувствителността към 10 антибактериални препарата е изпитана чрез дисково-дифузионния метод, епсилометричен тест (Е тест ) и автоматизирана система Phoenix. Изпитването на ефекта от 5 антибиотични комбинации е извършено чрез Е-тест-базиран метод. За фенотипна детекция на бета-лактамази е използван двойно-дисковия дифузионен тест, както и изоелектрично фокусиране и биологичен тест, а за детекция на гени, кодиращи ESBL от клас А ( CTX-M, TEM, SHV) – групово-специфична PCR. За детекция на гени, кодиращи резистентност към сочения за средство на избор антибактериален препарат trimethoprim/sulfametoxazole е проведена PCR за sul1 гени при всички изолати, предварително установени като устойчиви към препарата. Епидемиологичното типиране е извършено чрез RAPD-PCR. Резултатите демонстрират пълна съпоставимост на идентификацията по трите използвани метода, като е отчетено съществено предимство на автоматизираната система Phoenix, чрез която значително се редуцира времето, необходимо за окончателна видова идентификация (средно 2,5 часа ). Представени са сравнителни данни за чувствителността на изолатите от четирите болнични заведения според типа отделение и вида на клиничния материал. Като механизъм на резистентност към trimethoprim/sulfametoxazole сред клиничните изолати S. maltophilia е доказан гена sul 1, отговорен за синтеза на форми на дихидроптероат синтетаза, нечувствителна към въздействието на препарата. Представени са данни за чувствителността на S. maltophilia към новия за клиничната практика антибиотик tigecyclinе, както и към colistin - едни от малкото препарати с активност срещу множествено резистентни Грам - отрицателни бактерии. Като препарати с най-добра активност спрямо S. maltophilia са установени tigecyclinе, trimethoprim/sulfametoxazole и doxycycline. Анализирани са възможностите за комбинирано приложение на антимикробни лекарствени средства в случаите на лечение на тежки инфекции, причинени от S. maltophilia. При значителен процент от изолатите S. maltophilia (над 50%) се демонстрира синергистичен ефект при комбинирането на trimethoprime/sulfametoxazole и levofloxacin с бета - лактамни препарати като ticarcillin/clavulanic acid и ceftazidime. Това дава основание тези комбинации да бъдат препоръчани за лечение на тежки инфекции, причинени от S. maltophilia. Проучването на клоналното разпространение на S. maltophilia в болничните екосистеми установи значително генетично разнообразие Идентифицираха са 16 малки кластера, състоящи се от 2 до 5 идентични или близко родствени изолати S. maltophilia. Не се установи доминиране на определен клон S. maltophilia в съответните клинични центрове през проучвания период от време.

Aim of the present study is to perform microbiological and molecular genetic research on epidemiology and resistance to antimicrobial drugs among clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. The survey covers a total of 168 isolates of Stenotrophomonas maltophilia, isolated for a period of eight years from 2007 to 2015 in four hospitals in Bulgaria. The identification was made by conventional biochemical methods, manual identification system Crystal and automated system Phoenix. Susceptibility to 10 antibiotics was tested by disk-diffusion method, epsilometer - test (E test) and by system Phoenix. The effect of 5 antibiotic combinations was done by E-test-based method. Phenotypic detection of beta-lactamase was made by double-disk diffusion test, and isoelectric focusing and bioassay. Group-specific PCR was done for detection of genes encoding class A ESBL (CTX-M, TEM and SHV). Detection of sul 1 genes, responsible for to trimethoprim / sulfametoxazole resistance was done by PCR in all isolates, previously identified as resistant to this drug. Epidemiological typing was performed by RAPD-PCR. The results demonstrate complete comparability of the identification for the three used methods, and report significant advantage of the automated system Phoenix, which significantly reduces the time required for definitive species identification (average 2.5 hours). The study presents comparative data on the susceptibility of isolates from four hospitals by type of clinical unit and type of clinical material. As a mechanism of resistance to trimethoprim / sulfametoxazole among clinical isolates of S. maltophilia was determinate gene sul 1, responsible for the synthesis of dihydropteroate synthase, insensitive to the drug. Study estimates sensitivity of S. maltophilia strains to the new antibiotic tigecycline, and to colistin - one of the few agents with activity against multi-resistant gram - negative bacteria. As antibiotics with highest activity against S. maltophilia were established tigecycline, trimethoprim / sulfametoxazole and doxycycline. Synergistic effect was demonstrated in a significant part of isolates S. maltophilia (above 50%) when combination of trimethoprime / sulfametoxazole and levofloxacin with beta - lactam agents (such as ticarcillin / clavulanic acid and ceftazidime) was tested. This findings demonstrate that these combinations can be recommended for the treatment of severe infections caused by S. maltophilia. The researches of clonal spread of S. maltophilia in hospital ecosystems found significant genetic diversity. Sixteen small clusters have been identified, each of them consisting of 2 to 5 identical or closely related isolates S. maltophilia.