Mechanism of Hepatocyte Survival in Experimental Model of Non-Alcoholic Fatty Liver and Antioxidants Intake // Механизъм на хепатоцитно оцеляване при експериментален модел на неалкохолен мастен черен дроб и прием на антиоксиданти

Abstract

Неалкохолната мастна чернодробна болест(НМЧБ) е най-разпространеното хронично чернодробно заболяване, свързана с нарастващата честота от затлъстяване, захарен диабет тип2, кардиометаболитни заболявания и се смята за неразделна част от метаболитния синдром. НМЧБ е клинико-патологичен синдром със широк спектър от увреждания, които варират от обикновена стеатоза до стеатохепатит, напреднала фиброза и цироза при липса на алкохолна злоупотреба. Неалкохолния стеатохепатит(НСХ) е напреднала форма НМЧБ, който е с необратими по характер увреждания и е най-бързо и стръмно увеличаващата се кохорта на болните-кандидати за чернодробна трансплантация. Конкретните причини и отличителни механизми за прогресията на обикновената стеатоза в НСХ и последващи увреждания не са достатъчно изяснени. Липсват разработени биомаркери, които да регистрират най-ранните алтеративни промени на хепатоцитите при липсващи макроскопски промени за чернодробни увреждания. Важно място в комплекса от рискови фактори заемат ниската двигателна активност, приема на високо-калорични храни и напитки, както и свръхпотреблението на диетична фруктоза. Предполага се, че инсулиновата резистентност, повишената продукция на провъзпалителни цитокини, свободни мастни киселини(СМК) и активни форми на кислорода(АФК) от хипертрофиралата мастната тъкан при затлъстяване, намалението на чернодробната антиоксидантна защита стимулира апоптозата на хепатоцитите и последващи чернодробни увреждания. На базата на тези данни ние създадохме хипотезата, че чернодробната апоптоза е ключов фактор в развитието и прогресирането на НСХ, а оксидативния стрес и възпалението в стеатозния черен дроб се очертават като основни звена в патофизиологичните механизми на клетъчните увреждания и смърт. Нашата цел бе, да се проучат някои възможни механизми на оцеляване на хепатоцитите при експериментален модел на метаболитен синдром с високо-фруктозна диета (ВФД) и прием на антиоксиданти. Въз основа на това си поставихме следните задачи: 1. Да се изследват метаболитните промени при ВФД: телесно тегло и тегло на ретроперитонеална мастна тъкан и черен дроб; нива на серумна глюкоза и липиден профил; нива и съотношение на наситени и ненаситени СМК в чернодробен хомогенат. 2. Да се изследват морфологичните (стеатоза) промени и някои биохимични показатели на чернодробна дисфункция. 3. Да се проучи ролята на оксидативния стрес (нива на МДА-малондиалдехида, редуциран глутатион и глутатион пероксидаза в серуми и чернодробен хомогенат и нискостепенното възпаление (изследване нивата на CRP, TNFa и пикочна киселина) за чернодробното увреждане. 4. Да се изследват апоптотични маркери (серумни- CK18 и тъканни- Bax, Bcl2 и CK18 протеини) при увреждане на черния дроб. 5. Да се проучат корелационни зависимостти между някои показатели на метаболитни нарушения, оксидативен стрес, възпаление и чернодробни увреждания. 6. Да се проучи хепатопротективния ефект на S-AMe(S-аденозилметионин) и Алопуринол при ВФД. За изпълнението на поставените задачи сме изследвали 4 групи мъжки плъхове (линия Wistar): на стандартна диета и 3 групи с ВФД(35% високо-фруктозен царевичен сироп, поставен като разтвор за пиене). 3-тата и 4 тата група са приемали съответно S-AMe и Алопуринол. Използвали сме имонологични, имунохистохимични, хроматографски и биохимични методи на изследване. Статистическата обработка на резултатите в проучването включва дескриптивни методи и аналитични методи (T –test (р ≤ 0.05); вариационен анализ (ANOVA, р<0.05); корелационен аналз (r > 0.5); Регресионен анализ. В настоящата разработка за първи път са проучени основни патофизиологични механизми на чернодробни увреждания свързани със затлъстяването, оксидативния стрес, възпалението и апоптоза при високо-фруктозна диета на плъхове и прием на S-AMе и Алопуринол. Резултатите от проучването доказват, че ВФД предизвиква метаболитни нарушения като затлъстяване, хипергликемия, дислипидемия и хиперурикемия, съответстващи на критериите за диагностика на метаболитния синдром при хора. Това от една страна определя съществената роля на високо-фруктозната диета за спонтанната проява на синдрома (за разлика от генетичните модели) и характеризира значението на хранителните фактори за развитието на затлъстяване и инсулинова резистентност, както и последващи метаболитни аномалии-дислипидемии, оксидативен стрес, нискостепенно възпаление, мастна дегенерация на черния дроб и апоптоза. От друга страна, резултатите подсказват установената от други автори роля на храненето за епигенетичните промени включени в регулацията на чернодробният глюкозен и липиден метаболизъм, някои от които са замесени в развитието и прогресирането на НМЧБ. Това прави експерименталният модел с ВФД иновативен по отношение на епигенетичните механизми и предлага нови перспективи за изследване на патогенезата на чернодробните увреждания, откриване на диагностични биомаркери и терапевтични стратегии за НМЧБ. Нашите данни представят убедителни доказателства, че при фруктозо-индуциран метаболитен синдром оксидативният стрес и нискостепенното системно възпаление са във функционална връзка с активираните апоптотични процеси (повишени съотношение на Bax/Bcl2 и CK18 протеин) в стеатозния черния дроб, което предполага, че апоптозата е доминиращ механизъм на клетъчна смърт при неалкохолен мастен черен дроб. Това налага и необходимостта от разработване и търсене на биомаркери за неинвазивно изсладване на активността на апоптозата и мониторирането й още в най-ранни етапи на чернодробна увреда. От друга страна нашите резултати показват, че затлъстяването и дисфункцията на висцералната мастна тъкан са основен патологичен фактор за интрахепатално отлагане на липиди и оксидативен стрес. Увеличената висцерална мастна тъкан е основен източник на повишена продукция на TNFа и експорт на СМК към черния дроб, които стимулирайки чернодробната инсулинова резистентност, de novo липогенеза и изчерпване на антиоксидантния капацитет на хепатоцитите предизвикват тъканни увреждания. В нашето проучване за първи път се установи въздействието на S-AMе и Алопуринол върху цитозащитата на хепатоцитите в условията на фруктозо-индуцираните метаболитни разстройства. Резултатите показват селективно действие на S-AMе и Алопуринол върху оксидативния стрес и производството на липиди, което протектира чернодробните клетки срещу клетъчна смърт и последващи увреждания. За разлика от други известни антиоксиданти, нашите данни показват, че S-AMе проявява антиоксидантно, антистеатозно и антиапоптотично действие. Благоприятното вляние върху липидния метаболизъм в черния дроб е значимо по-изразено от това на Алопуринола. Все повече доказателства сочат, че дисрегулацията на енергийния метаболизъм при НМЧБ е свързана и с епигенетични механизми на увреда, зависещи от адекватната биосинтеза на S-AMе, която е потисната при чернодробни увреждания. Следователно, екзогенния внос на S-AMе вероятно проявява хепатопротективно действие и чрез епигенетични промени в регулацията на чернодробния липиден метаболизъм. Тези данни представляват съществен интерес за нас и са предмет на нашите бъдещи проучвания. Резултатите от настоящото проучване показват, че защитният ефект на Алопуринола срещу продукцията на пикочна киселина и ксантиноксидаза-зависимото производство на АФК го прави конкурентен по отношение на антиоксидантната активност на S-AMе (а вероятно и спрямо други антиоксиданти). В групата на лечение с Алопуринол са установени по-ниски нива на МДА и по-високи нива на GSH спрямо групата приемаща S-AMе. Това предполага, че продуцирането на АФК от ксантиноксидазата е от съществено значение за фруктозо-индуцирания оксидативен стрес и нивата на пикочната киселина са значимо свързани с неалкохолния мастен чрен дроб. На базата на представените резултати може да се направи заключение, че апоптозата е съществен фактор в развитието и прогресирането на неалкохолния мастен черен дроб при ВФД, а оксидативния стрес и системното възпаление се очертават като основни звена в патофизиологичните механизми на клетъчни увреждания и смърт. Доказаният антиоксидантен, антилипидемичен, антистеатозен и хепатопртективен ефект на S-AMе и Алопуринол, разкрива нови възможности за терапевтично повлияване на свързаните със затлъстяването и инсулинова резистентност метаболитни нарушения. ИЗВОДИ 1. Високо-фруктозната диета приложена на плъхове предизвиква метаболитни нарушения, които отговаря на основните критерии за диагностика на МС при хора. 2. Промените в чернодробното съдържание на СМК (повишено съотношение на наситени/ненаситени СМК) са важен показател за адипоцитна дисфункция, инсулинова резистентност, повишена липидогенеза и оксидативен стрес при ВФД. 3. Апоптозата е доминиращ механизъм на клетъчна смърт (повишено съотношение на Bax/Bcl2 и CK18 протеини) при системно нискостепенно възпаление, оксидативни увреждания и мастна дегенерация на черния дроб индуцирани от ВФД. 4. Установена е функционална връзка между оксидативният стрес, нискостепенното системно възпаление и активираните апоптотични процеси в стеатозния черния дроб. 5. Прилагането на S-AMе и Алопуринол предотвратява фруктозо-индуцираните метаболитни нарушения при плъхове, потиска системният възпалителен отговор, ограничава оксидативните процеси и мастна дегенерация в черния дроб. 6. Приложението на S-AMе и Алопуринол при ВФД проявява селективен ефект: влиянието на S-AMе върху липидният метаболизъм е значимо по-изразено от Алопуринола, докато ефектите на Алопуринола върху оксидативния стрес са значимо по-изразени от тези на S-AMе. 7. Приложението на S-AMе и Алопуринол инхибира активираните апоптотични процеси и по този начин протектира оцеляването на хепатоцитите в условията на фруктозо-индуцираните оксидативни и метаболитни тъканни увреждания. 8.Съотвествието на серумните нива на апоптотичния СК-18 протеин с хистологичните и биохимични промени в черния дроб на експерименталните животни го определят като подходящ биомаркер за неинвазивна оценка на степента на чернодробните увреждания, тяхната прогресия и ефекта от прилагането на терапии при НМЧБ в експериментални и клинични условия.

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common chronic liver disease which is associated with the increasing of obesity, diabetes type 2, cardiometabolic diseases and metabolic syndrome. NAFLD includes a spectrum of diseases ranging from isolated hepatic steatosis to nonalcoholic steatohepatitis (NASH), progressive fibrosis and cirrhosis. NASH is its advanced form which is irreversible damage and is the fastest growing cohort of patients-candidates for liver transplantation. The specific reasons and distinctive mechanisms of this progression are not completely understood. There is a lack of noninvasive and widely available biomarkers for the diagnosis of the earliest reversible liver injury. The dramatic rise in prevalence of fatty liver disease, obesity and diabetes is associated with increased caloric intake, a lower physical activity and overconsumption of dietary fructose. Recent data suggest that insulin resistance, increased of proinflammatory cytokines production and free fatty acid (FFA) flux from adipose tissue to the liver, and reactive oxygen species (ROS), commonly associated with obesity, lead to hepatic accumulation of triglycerides (TG) and decrease in antioxidant protection which activated hepatic apoptosis and irreversible liver damage promotion. Based on these data, the hypothesis that hepatic apoptosis is a key factor in the development and progression of NASH and oxidative stress and inflammation in fatty liver are emerging as major links in pathophysiological mechanisms of cellular damage and death, was developed. Our aim was to investigate the possible mechanisms of hepatocyte survival in fructose-induced metabolic syndrome and an antioxidants administration. The following tasks were performed: 1. We studied metabolic changes in HFD (high-fructose diet): body weight; the retroperitoneal tissue and liver weight; serum levels of glucose, lipids; the levels and ratio of hepatic saturated to unsaturated fatty acids. 2. We studied histological changes and biochemical parameters of liver dysfunction. 3. We investigated the role of ROS (levels of MDA-malondialdehyde, reduced glutathione and glutathione peroxidase in sera and liver homogenates) and low-level inflammation (serum levels of CRP, TNFa and uric acid) for liver damage. 4. We studied the apoptotic markers (serum cytokeratin-18 (CK-18); tissue- Bax, Bcl2 and CK-18) in fatty liver. 5. We examined the correlations between some of the indicators of metabolic disorders, oxidative stress, inflammation and hepatic impairment. 6. We studied hepatoprotective effects of S- adenosylmethionine (S-AMe) and Allopurinol in fructose-inducible fatty liver. Methods: We used a model of high-fructose diet (HFD) in male rats Wistar (16 weeks, 35% glucose-fructose corn syrup), divided into 4 groups: 1. control; 2. HFD; 3. HFD and S-AMe administration and 4. HFD and Allopurinol. We used immunoassays, immunohistochemistry, chromatographic, biochemical test methods. The statistical processing of the results included descriptive and analytical methods (t-test; p <0.05); analysis of variance (ANOVA, p <0.05); correlation analysis (р > 0.5); regression analysis. In this study for the first time were investigated basic pathophysiological mechanisms of liver damage associated with obesity, oxidative stress, inflammation and apoptosis in an experimental model of high-fructose diet and S-AME and Allopurinol administration. The results showed that HFD causes metabolic disturbances such as obesity, hyperglycemia, hypertriglyceridemia, hyperuricemia, low-level inflammation and microvesicular steatosis, consistent with criteria for diagnosis of metabolic syndrome in humans. Our data provide evidence that the fructose-induced oxidative stress and low-level inflammation are functionally linked with activated apoptotic processes in fatty liver. This is indicative that apoptosis is the dominant mechanism of cell death in NAFLD. On the other hand, our results showed that obesity and visceral adipose tissue dysfunction is a major pathological factor for intrahepatic deposition of lipids. Excess body mass is a source of TNFa production, the export of FFA to the liver, stimulates hepatic insulin resistance and de novo lipogenesis, a change in the redox enzyme activity, excessive ROS loading, mitochondrial dysfunction and fatty liver. In our study, it was found the effect of S-AME and Allopurinol administration on cytoprotection of hepatocytes under conditions of fructose-induced metabolic disturbances. Our data demonstrate the selective effect of S-AME and Allopurinol оn oxidative stress and the production of lipids, which protects hepatocytes against cell death and further damage. As a precursor of glutathione S-AME improves antioxidant defenses in hepatocytes. This effect likely modulates the expression of hepatic Bcl-2 family proteins by increasing anti-apoptotic Bcl-2 protein, suppressed apoptosis and protects against oxidative damage in the liver. Growing evidence suggests that dysregulation of energy metabolism in NAFLD is associated with epigenetic mechanisms of damage dependent on the S-AMe biosynthesis that is suppressed in hepatic impairment. Therefore, the S-AMe administration probably occurs through hepatoprotective action and epigenetic changes in the regulation of hepatic lipid metabolism. These data represent substantial interest to us and are subject to our future studies. The protective effect of Allopurinol for the production of uric acid and xanthine oxidase (XO)-dependent production of ROS, makes it competitive as regards the antioxidant activity of S-AMe (and possibly to other antioxidants). In the group of treatment with Allopurinol were established lower levels of MDA and higher levels of GSH compared to the group receiving S-AMe. This suggests that the XO-dependent production of ROS in parallel with metabolic changes are essential for fructose-induced oxidative stress and the uric acid levels are significantly associated with non-alcoholic fatty liver. Our results show that elevated serum levels of CK-18 were consistent with the hepatic histological (Bax/Bcl2 ratio and CK-18 levels) and biochemical changes in the four experimental groups. This suggests that apoptosis is essential implicated in the pathogenesis of HDF-induced liver damage in rats, and the blood measurements of soluble CK18 present a viable means for monitoring apoptotic cell death. In conclusion, these findings suggest that apoptosis is a crucial factor in the development and progression of non-alcoholic fatty liver in HFD, and oxidative stress and low-level inflammation are emerging as key links in pathophysiological mechanisms of cellular damage and death. The S-AMe and Allopurinol administration may represent a novel, protective strategy against nonalcoholic liver injury by attenuating oxidative stress, inflammatory and apoptosis.